PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA DE GLÚCIDOS

Materiales:

- Disoluciones diluidas (2 g. en 100 ml.) de glucosa, maltosa, sacarosa o azúcar común y almidón.
- Reactivo de Fehling A y B.
- Lugol (solución iodada).
- Ácido clorhídrico al 50 %.
- Gradilla con tubos de ensayo, pinzas sujetatubos, pipetas y mechero.

Desarrollo de la práctica:

Se preparan tres tubos de ensayo con 2 ml. de la solución de glucosa, otros tres con la misma cantidad de la solución de maltosa, otros tres con la misma cantidad de la solución de sacarosa y otros tres con la misma cantidad de la de almidón.

En un tubo de cada tipo de glúcido se añade 1 ml. de reactivo de Fehling A y, con otra pipeta, 1 ml. de reactivo de Fehling B. Se calienta con cuidado hasta el comienzo de la ebullición. Si el glúcido presente tiene poder reductor (prueba positiva), el líquido deberá adquirir un color rojizo al formarse un precipitado de este color que se produce cuando el ión cúprico del Fehling pasa a cuproso.

En los tubos que han dado negativo en la prueba anterior se añaden 2 ml. de HCl al 50 % y se calientan suavemente. A continuación se repite la prueba del Fehling. Dar una explicación a los resultados obtenidos.

En otro tubo de cada tipo de glúcido se añaden unas gotas de lugol. Si la prueba es positiva la disolución se tiñe de violeta. Anotar el resultado. Posteriormente, se calienta la disolución teñida de violeta hasta que pierda el color. Dejar enfriar el tubo bajo el grifo, esperar unos minutos y anotar lo que sucede. Explicar los resultados.

Poner en otro tubo de ensayo 2 ml. de la disolución de almidón y una cierta cantidad de saliva. Mezclarlo bien y calentar ligeramente durante poco tiempo. Añadir unas gotas de lugol y anotar los resultados. Realizar un análisis comparativo entre esta prueba y la anterior.

Completar el siguiente cuadro:

Glúcido
Fehling
Fehling + HCl
Lugol
GLUCOSA
+ ó -
+ ó -
+ ó -
MALTOSA
+ ó -
+ ó -
+ ó -
SACAROSA
+ ó -
+ ó -
+ ó -
ALMIDÓN
+ ó -
+ ó -
+ ó -

EXPERIENCIAS CON LÍPIDOS

1.- Prueba de solubilidad

Colocar en un tubo de ensayo 2 ml. de aceite y añadir 2 ml. de un disolvente apolar (por ejemplo cloroformo o éter de petróleo). En otro tubo hacer lo mismo, pero añadir agua en vez de disolvente apolar. Agitar y anotar los resultados.

2.- Tinción con Sudán III

Poner 2 ml. de aceite en un tubo, añadir 2 ml. de agua y dejar reposar. Una vez formadas las dos fases, dejar caer unas gotas de Sudán III y agitar. Dejar reposar el tubo y anotar los resultados.

Colocar 2 ml. de leche en un tubo, verter 10 ml. de agua, unas gotas de Sudán III y agitar fuertemente. Observar que se tiñe todo de rosa. Si añadimos 1 ml. de HCl al 50 % y calentamos aparecerán, dependiendo del tiempo de reposo, dos o tres fases:

a) una superior, de color rosa oscuro, formada por las grasas teñidas.
b) una intermedia, con agua y lactosa disuelta.
c) una inferior, con las proteínas desnaturalizadas.

3.- Prueba de la emulsión.

Poner 2 ml. de aceite en un tubo, añadir 10 ml. de agua, agitar fuertemente, esperar unos minutos y anotar lo sucedido. Añadir después 1 ml. de una solución concentrada de jabón líquido, volver a agitar, esperar unos minutos y anotar lo sucedido.

4.- Prueba de la saponificación.

Colocar 2 ml. de aceite y 2 ml. de Na OH al 20 %, hervir suavemente (de forma controlada) y agitar durante algunos minutos. Dejar reposar y aparecerán dos o tres capas:

a) Superior (puede no aparecer): aceite que no ha reaccionado.
b) Intermedia semisólida de jabón.
c) Inferior: glicerina disuelta en el agua.


EXPERIENCIAS CON PROTEÍNAS

Desnaturalización o coagulación de proteínas

Hacer series de 4 tubos de ensayo con 2 ml de una disolución de albúmina al 2 % y numerar los tubos. Realizar la misma operación con leche y con una disolución de clara de huevo (una clara en 500 ml de agua con sal).

A los tubos nº 1 añadir 2 ml de HCl, a los nº 2 se les añade 2 ml de una disolución concentrada (al 4 %) de NaCl, a los nº 3 añadir 2 ml de NaOH al 20 % y a los nº 4 se les calienta suavemente. Interpretar los resultados.

Prueba de Biuret

El Biuret es una reacción típica de los enlaces peptídicos, en la cual los átomos de cobre del reactivo se unen a varios grupos NH, lo que produce una coloración rosa-violácea. Esta reacción no sirve para dipéptidos ni para aminoácidos.

Colocar en tubos diferentes disoluciones proteínicas, añadir igual cantidad de una disolución de NaOH al 20 %, agitar y dejar caer 4 o 5 gotas de CuSO4 al 1 %. Interpretar los resultados.

Prueba xantoproteica

Esta prueba consiste en la nitración de anillos de fenol presentes en ciertos aminoácidos, con la consiguiente formación de nitrocompuestos de color amarillo.

Añadir a cada tubo de ensayo 2 ml de cada disolución de proteína, verter la misma cantidad de HNO3 al 40 %, anotar la coloración, calentar al baño María y anotar los resultados.

Prueba enzimática: reconocimiento de la catalasa

La catalasa acelera la siguiente reacción: 2 H2O2 = 2 H2O + O2

Colocar en tubos de ensayo aproximadamente el mismo peso de varios tejidos animales y vegetales, añadir a cada tubo 5 ml de H2O2 y anotar lo que sucede. Explicar lo que está ocurriendo y ordenar los tejidos según su actividad enzimática.

Repetir el mismo proceso anterior, pero hervir antes los tejidos durante unos diez minutos. Explicar los resultados obtenidos.


RECONOCIMIENTO DE PRINCIPIOS INMEDIATOS EN LA LECHE

MATERIALES

- Gradilla con 12 tubos de ensayo.
- Pinza de madera para sujetar los tubos.
- Espátula metálica.
- Embudo.
- Papel de filtro.
- Mechero.
- Vaso de precipitados.
- Pipeta Pasteur o cuentagotas.
- Pipetas graduadas.
- Bombona de agua.

PRODUCTOS BIOLÓGICOS Y REACTIVOS

- Leche entera.
- Leche fermentada de forma natural.
- Ácido clorhídrico puro.
- Ácido clorhídrico: solución al 50 %.
- Ácido nítrico puro.
- Cloruro sódico: solución concentrada.
- Hidróxido sódico: solución al 20 %.
- Reactivo de Benedict o de Fehling.
- Sudan III: solución alcohólica al 0,5 %.

OBJETIVOS

Se pretende conseguir que el alumnado compruebe de forma sencilla la existencia de diversos principios inmediatos fundamentales como proteínas, grasas y azúcares en un alimento básico como la leche, así como el comportamiento de las proteínas lácteas ante determinados cambios físicos y químicos.

PROCEDIMIENTO

A) Desnaturalización o coagulación de proteínas lácteas.

Hacer una serie de cuatro tubos de ensayo y numerarlos.
Al tubo nº 1 se le añade 2 ml de leche y 2 ml de HCl puro.

Al tubo nº 2 se le añade igual cantidad de leche y 2 ml de una disolución concentrada de NaCl.

Al tubo nº 3 añadir 2 ml de leche y 2 ml de NaOH al 20 %.

Al tubo nº 4 se le añade 2 ml de leche y después se le calienta levemente.

Anotar los resultados obtenidos y comparar los diferentes tubos.

B) Reconocimiento de grasas en la leche.

Colocar 2 ml de leche en un tubo de ensayo, añadir 10 ml de agua y unas gotas de Sudan III y agitar fuertemente. Observar que se tiñe todo de rosa. Si añadimos 1 ml de HCl al 50 % y calentamos pueden aparecer dos o tres fases:

a) superior, de color rosa, formada por las grasas teñidas por el Sudan III, que es un colorante específico de grasas.

b) intermedia, con el agua y ciertos compuestos solubles, como la lactosa y algunas proteínas disueltas (lactoalbúmina y lactoglobulina).

c) inferior, con las proteínas coaguladas y precipitadas.

C) Reconocimiento de glúcidos en la leche.

Se recoge aparte con una pipeta Pasteur o cuentagotas la fase soluble de la prueba anterior, se filtra y se añade 1 ml del filtrado a un tubo de ensayo. A este tubo se le agrega 1 ml del reactivo de Fehling (o de Benedict) y se le calienta durante unos minutos. Si la prueba es positiva (hay presencia de un glúcido reductor, en este caso la lactosa) aparecerá un precipitado de óxido de cobre, de color rojo.

D) Reconocimiento de proteínas en la leche: Prueba xantoproteica.

Recoger con una espátula el precipitado de la leche coagulada (caseína), llevarlo a un trozo de papel de filtro y secarlo. Poner en un tubo de ensayo una pequeña porción del precipitado seco, añadir unas gotas de ácido nítrico puro y calentar ligeramente. Anotar los resultados obtenidos.


ESTUDIOS ENZIMÁTICOS

1.- Hidrólisis enzimática del almidón por la saliva: Acción digestiva de la amilasa salivar.

Primero se hace un tubo patrón con 2 ml. de una disolución de almidón al 2 % y unas gotas de disolución de yodo (lugol). Observar el resultado. Después se calienta suavemente el tubo hasta que la mezcla pierda el color. Dejar enfriar el tubo bajo el agua del grifo y esperar unos minutos. Anotar lo sucedido.

Colocar en un segundo tubo 2 ml. de la disolución de almidón y una cierta cantidad de saliva, mezclar bien la saliva con la disolución y calentar muy suavemente durante unos segundos. Añadir unas gotas de lugol. Anotar los resultados y dar una explicación a lo ocurrido.

2.- Reconocimiento de la enzima catalasa en tejidos.

La catalasa se encuentra tanto en tejidos vegetales (patata, zanahoria, lechuga, etc.) como en tejidos animales (carne, pescado, etc.) produciendo la siguiente reacción química:

H2O2 (agua oxigenada) ==== H2O + ½ O2 (gaseoso)

Es decir, la enzima descompone el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada en agua y oxígeno gaseoso, que se desprenderá en forma de burbujas en un medio acuoso.

Poner en varios tubos de ensayo previamente numerados distintos tejidos (más o menos el mismo peso de cada tejido). Añadir 5 ml. de agua oxigenada a cada tubo y anotar lo que sucede. Explicar lo ocurrido y ordenar los tejidos según su actividad.

Repetir el proceso anterior, pero hervir antes los tejidos durante diez minutos. Explicar los resultados obtenidos.

3.- Actividad catalítica de la catalasa.

En un tubo de ensayo se coloca un trozo de hígado (o 1 ml. de extracto de hígado) y 10 ml. de agua oxigenada. Se cierra el tubo con un tapón, que se deja algo flojo para el escape de los gases producidos en la reacción, en cuyo centro exista un orificio por el cual se pueda introducir un termómetro. Así, hemos hecho un calorímetro.

Se anota la temperatura ambiente, que se toma como temperatura inicial de la reacción, y después se va anotando las variaciones de temperatura que se producen en el interior del calorímetro cada treinta segundos durante un período de cinco minutos. Hacer la gráfica de la reacción y explicar los resultados.